Isolera klonen
I allmänhet utförs kloning för att erhålla klonen av en speciell gen eller DNA-sekvens av intresse. Nästa steg efter kloning är därför att hitta och isolera den klon bland andra bibliotekets medlemmar. Om biblioteket omfattar hela organismen genomet, kommer någonstans inom biblioteket att vara den önskade klonen. Det finns flera sätt att hitta den, beroende på den specifika genen som berörs. Vanligtvis används ett klonat DNA-segment som visar homologi med den sökta genen som sond. Till exempel, om en musgen redan har klonats, kan den klonen användas för att hitta den ekvivalenta humana klonen från ett humant genomiskt bibliotek. Bakteriekolonier som utgör ett bibliotek odlas i en samling petriskålar. Sedan läggs ett poröst membran över ytan på varje platta, och celler fäster vid membranet. Cellerna bryts och DNA separeras i enstaka strängar - allt på membranet. Sonden separeras också i enstaka strängar och märks, ofta med radioaktiv fosfor. En lösning av den radioaktiva sonden används sedan för att bada membranet. Ensträngat sond-DNA kommer endast att vidhäfta till klonets DNA som innehåller den ekvivalenta genen. Membranet torkas och placeras mot ett ark med strålningskänslig film, och någonstans på filmerna kommer en svart fläck att dyka upp och meddela närvaron och plats för den önskade klonen. Klonen kan sedan hämtas från de ursprungliga petriskålarna.
genetik: Rekombinant DNA-teknik och polymeraskedjereaktionen
Tekniska framsteg har spelat en viktig roll i utvecklingen av genetisk förståelse. 1970 amerikanska mikrobiologer Daniel Nathans
DNA-sekvensering
När ett DNA-segment har klonats kan dess nukleotidsekvens bestämmas. Nukleotidsekvensen är den mest grundläggande kunskapsnivån för en gen eller genom. Det är planen som innehåller instruktionerna för att bygga en organisme, och ingen förståelse för genetisk funktion eller evolution kan vara fullständig utan att få denna information.
användningsområden
Kunskap om sekvensen för ett DNA-segment har många användningsområden, och några exempel följer. Först kan den användas för att hitta gener, DNA-segment som kodar för ett specifikt protein eller fenotyp. Om en region av DNA har sekvenserats kan den screenas med avseende på karakteristiska egenskaper hos gener. Till exempel öppna läsramar (ORF) - långa sekvenser som börjar med ett startkodon (tre angränsande nukleotider; sekvensen för ett kodon dikterar aminosyraproduktion) och är oavbrutna av stoppkodoner (förutom en vid deras avslutande) - sugger a proteinkodande region. Dessutom ligger mänskliga gener i allmänhet intill så kallade CpG-öar - kluster av cytosin och guanin, två av nukleotiderna som utgör DNA. Om en gen med en känd fenotyp (såsom en sjukdomsgen hos människor) är känd för att vara i den sekvenserade kromosomregionen, kommer icke tilldelade gener i regionen att bli kandidater för den funktionen. För det andra kan homologa DNA-sekvenser för olika organismer jämföras för att plotta evolutionära förhållanden både inom och mellan arter. För det tredje kan en gensekvens screenas för funktionella regioner. För att bestämma funktionen av en gen kan olika domäner identifieras som är vanliga för proteiner med liknande funktion. Exempelvis finns vissa aminosyrasekvenser inom en gen alltid i proteiner som sträcker sig över ett cellmembran; sådana aminosyresträckningar kallas transmembrane domäner. Om ett transmembrandomän hittas i en gen med okänd funktion antyder det att det kodade proteinet är beläget i cellmembranet. Andra domäner karakteriserar DNA-bindande proteiner. Flera offentliga databaser över DNA-sekvenser är tillgängliga för analys av alla intresserade personer.
